威尼斯官方网站授粉的过程 时间 变化

威尼斯官方网站原位生长过程中Ca2+的超微细胞化学定位

齐秀娟1,2,张绍铃1*,方金豹2

(1南京农业大学梨工程技术研究中心,南京 210095;2中国农业科学院郑州果树研究所,果树生长发育与品质控制重点开放实验室 郑州 450009)

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摘要:应用扫描电镜和荧光显微镜对软枣猕猴桃同种花粉在柱头上原位萌发及花粉管生长情况进行了观察,并用焦锑酸盐沉淀法对其授粉前后柱头及花柱中Ca2+进行超微细胞化学定位,研究结果表明:(1)猕猴桃柱头属于干性柱头,具有一道裂沟, 乳突呈长圆柱形,授粉前后形态差异不明显;(2)授粉后3h,花粉管生长穿过柱头表面,授粉后7h,生长到达花柱底部;(3)授粉前后,柱头接受面靠近柱头外围细胞的角质层一侧细胞器内含有丰富的钙,而柱头非接受表面钙颗粒分布很少;(4)授粉前和授粉后3h,花柱顶端钙颗粒较少,基部钙颗粒较多;授粉后7h,花柱顶端和基部钙分布密度无明显差别;(5)授粉前后花柱顶端钙主要均匀分布在细胞质膜位置;在花柱基部授粉前主要在引导组织胞间隙中,授粉后3h主要在细胞质内,授粉后7h主要存在于细胞质、内质网上。猕猴桃授粉前后,柱头和花柱组织中均含有钙,授粉前和授粉后3h花柱中的钙呈现出梯度分布,授粉后7h钙的梯度分布现象减弱甚至消失。
关键词:软枣猕猴桃;柱头;花柱;钙
Ultracytochemical Localization of Calcium in Pollen Situ Growth of Kiwifruit

QI Xiu-juan1,2,ZHANG Shao-ling1*,FANG Jin-bao2

(1 Pear Engineering Research Centre,Nanjing Agriculture University,Nanjing,Jiangsu 210095,Chin, China;;2Key Laboratory for Fruit Tree Growth, Development and Quality Control, Zhengzhou Fruit Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450009,China)

Abstract: Fluorescence microscope and scanning electron microscopy were used to observe pollen germination and pollen tube growth, Potassiam antimonate was used to localize calcium in stigma and style tissue of A.argutar before and after pollination.(1)Stigma of A.argutar was dry, it was long cylindrical Shape and had a crack ditch, the form difference was not obvious before and after pollination. (2)3h after pollination , pollen tube grew through stigma surface, and got to basal style 7h after pollination (3)Receptive surface of stigma, Cuticle organelles were rich in calcium granules before and after pollination, but no-receptive surface of stigma, organelles had little calcium granules.(4)Top style had little calcium, but basal style had more calcium before and 3h after pollination. The calcium contents were briefly identical in top and basal style 7h after pollination. (5)The calcium distributed in plasma membrane of top style before and after pollination, in intercellular gap of basal style before pollination, in plasma membrane of basal style 3h after pollination, and in plasma membrane and endoplasmic reticulum of basal style 7h after pollination. Stigma and style tissue of A.argutar were rich in calcium before and after pollination. Calcium of style showed the gradient distribution before and 3h after pollination, it weakened or disappeared 7h after pollination.

Keywords: A.argutar; stigma; style; caleium

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钙是植物体内重要的第二信使,其在植物体内的分布及浓度变化,调节着许多代谢和发育过程[1]。钙在花粉萌发和花粉管向性生长中的重要作用已在多种植物的离体花粉培养实验中证实[2-4]。研究表明,离体生长的花粉管需要不断的从外界吸取Ca2+以维持花粉管顶端的游离Ca2+梯度分布,为其极性生长创造条件,同时生长的花粉管需要源源不断的将Ca2+补充到新形成的花粉管的果胶层中以增强花粉管壁的硬度[5]。迄今为止,虽然植物有性生殖中Ca2+功能的研究已经取得了重大进展,但是还有很多问题尚需要解决。有关Ca2+调节花粉管生长的结果大多是在离体条件下获得的,花粉管在离体和体内生长的环境条件不尽相同,尽管离体生长系统可以模拟但不能完全代替花粉管的体内生长状况,所以要了解受精过程雌蕊组织中Ca2+与花粉管生长的关系,还需研究花粉管生长途径的雌蕊组织中Ca2+分布状况。与离体花粉萌发和花粉管生长过程中Ca2+作用机理的研究相比,对体内雌蕊组织中的Ca2+与花粉萌发和花粉管生长的关系则研究相对较少,尤其是雌蕊的柱头和花柱组织中Ca2+分布的研究更少[5]。近20年来用焦锑酸钾方法虽然已对多种植物的柱头和花柱组织进行了观察,并发现柱头和花柱引导组织中分布有丰富的Ca2+,但是柱头、花柱组织中是否存在一个引导花粉管生长的Ca2+分布梯度问题至今尚无定论,需要广泛采用多种植物进行研究。就研究对象而言,果树作物有关雌蕊体内Ca2+分布的研究还属空白。本研究利用荧光显微镜及扫描电镜观察威尼斯官方网站原位萌发及花粉管生长的基础上,结合利用焦锑酸钾沉淀法研究猕猴桃授粉前后柱头与花柱中的Ca2+分布变化,旨在揭示猕猴桃树种花粉管原位生长过程中柱头与花柱组织中Ca2+的分布问题。

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1 材料与方法
1.1材料

试验于2010年5月采用中国农业科学院郑州果树研究所猕猴桃资源圃(113°71′E, 34°71′N)内的软枣猕猴桃(A. argutar)品种‘天源红’进行,该品种在郑州地区花期为5月6日~11日。在大蕾期用中国农业科学院郑州果树研究所果袋公司生产的石榴专用羊皮纸袋进行单花套袋,在开花当天上午9时用事先准备好的同种花粉进行人工点授,授完粉后再马上重新套袋。

1.2方法

1.2.1花部特征观察

在初花期上午9时左右选择树体中部、树冠外围的典型花朵,肉眼观察花的结构特征。

1.2.2荧光显微镜观察

在授粉前、授粉后3h和7h,分别采集花朵用冰壶带回实验室,马上用刀片从花柱基部(子房与花柱连接处)切取花柱(含柱头),FAA固定液固定。花柱的压片参照Kho等[6]的方法,从固定液中取出花柱,用蒸馏水冲洗2遍,用2mol×L-1的NaOH放置在65℃的恒温箱中软化处理3h,然后用0.1mol×L-1K3PO4溶液配制的0.1%的苯胺兰染色液染色3h。染色后的花柱做成压片,用日本OLYMPUS BX51型荧光显微镜观察花粉萌发和花粉管的生长情况,各处理分别观察5朵花的10根花柱,选取典型图片拍照。

1.2.3扫描电镜观察

取授粉前和授粉后3h的柱头样品用2.5%戊二醛和1%锇酸双固定,经0.1 mol×L-1磷酸缓冲液(pH7.8)冲洗、丙酮梯度脱水、醋酸异戊酯置换、临界点干燥、粘样和喷金后, 置于XL30ESEM环境扫描电镜下,观察柱头表面结构及花粉与柱头的附着状态并拍照。各处理分别观察5朵花的10根花柱柱头,选取典型图片拍照。

1.2.4 Ca2+超微细胞化学定位

采用焦锑酸钾沉淀法进行Ca2+的超微细胞化学定位。在授粉前、授粉后3h和7h分别选择5朵花,用单面刀片切取柱头、花柱顶端(柱头下1mm处)和花柱基部(子房上1mm处)1mm左右,将样品迅速投入到含2.5%戊二醛和2%焦锑酸钾的0.1 mol× L-1磷酸缓冲溶液(pH7.8)配制的前固定液中室温下抽气并固定3h,然后用含2%焦锑酸钾、0.1 mol× L-1磷酸缓冲溶液(pH7.8)配置的洗涤液清洗3次,每次30min,再将材料转入0.1mol× L-1磷酸缓冲溶液配制的含1%锇酸、2%焦锑酸钾的后固定液中在4℃下固定16h左右,用相同的洗涤液清洗3次,每次30min。系列梯度丙酮脱水,Epon812树脂包埋。包埋的柱头和花柱材料用超薄切片机切片,切片厚度为70nm,切片不进行染色,用日立Hitach-6050型透射电子显微镜观察和拍照。

2结果与分析

2.1‘天源红’的花部特征

‘天源红’为软枣猕猴桃雌性品种,单花或二歧聚伞花序,每花序有花1~3朵,辐状花冠,冠径约15~18mm;花萼5~6片,偶有4片,绿略带红色,卵形;花瓣白色,略有片状红晕,近圆形,基部相接,边缘无波皱,中间有一浅裂;雄蕊多数,花药黄黑色,花粉粒空瘪,花丝退化或极短;单花花柱21~23个,长度(0.42±0.25)cm,白色,斜生或水平;子房上位,瓶状,绿色,纵径长(2.68±0.18)mm,无毛。(图版Ⅰ,1)。

2.2花粉粒在柱头表面的萌发和花粉管生长路径

通过荧光显微镜观察发现,‘天源红’授粉后3h,很多柱头上花粉粒大量萌发,多数花粉管已经穿过柱头表面,进入柱头内部(图版Ⅰ,2)。授粉后7h,很多花粉管已生长到花柱底部(图版Ⅰ,3)。通过扫描电镜观察柱头具有一道裂沟(图版Ⅰ,4),表面有大量乳突细胞分布,无黏液分泌,乳突呈长圆柱形,顶端呈钝圆、尖凸或凹陷三种形态(图版Ⅰ,5)。比较授粉前(图版Ⅰ,5)和人工授粉后3h (图版Ⅰ,6)的柱头, 二者形态差异不明显,仅个别乳突细胞表面纹理增多、凹陷变深。无论在光镜下还是在电镜下都可以观察到萌发后的花粉管从乳突细胞的间隙进入柱头的内部(图版Ⅰ,2和图版Ⅰ,6)。

2.3授粉前后Ca2+分布的变化

2.3.1授粉前后柱头Ca2+的分布变化

‘天源红’柱头为干性柱头,柱头的乳突细胞下面为花柱引导组织。乳突细胞相对的内表面为花粉接受面,外表面为非接受面。在未授粉的大蕾期,靠柱头外围角质层一侧细胞壁、细胞质、线粒体、内质网、液泡等细胞器里均含有许多Ca2+颗粒(图版Ⅰ,7),而在柱头非接受面表皮细胞壁中Ca2+几乎没有分布(图版Ⅰ,8),这种Ca2+分布状态与离体花粉萌发和花粉管生长时需要胞外Ca2+的试验结果相一致。

授粉后3h,柱头细胞壁外围、细胞质里有一些Ca2+颗粒沉淀(图版Ⅰ,9)。授粉后7h柱头细胞外表的细胞壁靠角质层一侧和液泡里仍分布有丰富的Ca2+颗粒(图版Ⅰ,10),随着柱头上附着的花粉萌发、花粉管的生长,花粉粒的萌发孔处的细胞壁中也出现很多Ca2+沉淀颗粒(图版Ⅰ,11),这些Ca2+沉淀可能与形成花粉管极性有关[7]。随着花粉管穿过柱头细胞向花柱引导组织中生长,在花粉管顶端壁中出现大量非常细小的Ca2+颗粒(图版Ⅰ,12),推测这些Ca2+沉淀可能与花粉管的转向生长有关[8-10]。柱头细胞质内还可见较大黑色颗粒(图版Ⅰ,13)推测可能是细胞质降解时产生的浓缩。同时,柱头非接受面授粉后Ca2+颗粒分布仍然很少(图版Ⅰ,14)。

2.3.2授粉前后花柱的Ca2+分布变化

猕猴桃花柱为闭合型,中央为引导组织,四周是具有较大细胞间隙的薄壁细胞组织。其中,引导组织是花粉管生长的通道,其胞间隙较发达。

未授粉前,花柱顶部Ca2+沉淀较少,主要均匀分布在细胞质中贴近质膜的位置,且颗粒相对较大,在引导组织胞间隙的中央、薄壁组织以及细胞壁中几乎没有Ca2+沉淀(图版Ⅰ,15);基部Ca2+数量较多,主要分布在引导组织胞间隙中,而且颗粒较大(图版Ⅰ,16),同时在细胞质膜和细胞壁内壁上也有少量较大颗粒的Ca2+沉淀。说明在授粉前花柱的顶端和基部组织已经出现了一个Ca2+梯度。

授粉后3h花柱顶端Ca2+的分布位置和沉淀量未见明显变化;在花柱基部,Ca2+大量沉积在细胞质内,而胞间隙未见存在(图版Ⅰ,17)。上述结果显示,授粉后3h,由于花粉管生长刚刚穿过柱头乳突细胞,花柱顶端的Ca2+相对较少而花柱基部的Ca2+相比较很多,Ca2+的梯度分布特征仍然保持。

授粉后7 h花柱顶端引导组织的横切面上(图版Ⅰ,18)可看到花粉管壁最外层, 即果胶质层及靠近管壁的胞间基质中,有少量的Ca2+沉淀;引导组织细胞壁内膜上积累了大量细小的Ca2+颗粒,在胞间隙里却未见分布(图版Ⅰ,19)。在花柱基部Ca2+颗粒主要分布在细胞质、内质网等部位,而在引导组织胞间隙、细胞壁内膜等部位没有Ca2+分布(图版Ⅰ,20)。透射电镜观察授粉后7h花柱顶部和基部的Ca2+沉淀量大致相同,说明当花粉管已生长到花柱底部进入子房以后,Ca2+分布位置明显变化,而且花柱中Ca2+梯度作用会减弱甚至消失。

3 讨论

3.1柱头表面内Ca2+的分布及其作用

很多种类的植物在接受花粉的柱头上都会积累大量的Ca2+,例如金鱼草[11]、番薯[12]、假叶树[13]、油菜[14]、向日葵[15]、棉花[16]、水稻[17]、甘蓝[18]、烟草[19]、莴苣 [20]等,这些Ca2+多分布于细胞壁和胞间基质等质外体系统中,均与其柱头上花粉的萌发有关。在本研究中,猕猴桃未授粉的柱头上,靠柱头外围角质层一侧细胞壁、细胞质、线粒体、内质网等细胞器里均含有许多Ca2+颗粒;授粉后3h,柱头细胞壁外围、细胞质里仍有一些Ca2+颗粒沉淀;授粉后7h柱头细胞外表的细胞壁靠角质层一侧和液泡里仍分布有丰富的Ca2+颗粒。这些丰富的Ca2+颗粒也与其柱头表面的花粉萌发有关。上述结果与很多植物花粉离体萌发实验中需一定Ca2+的原因相一致,表明离体花粉萌发和花粉管伸长需要从培养基中吸取胞外Ca2+的过程在体内由柱头表皮细胞提供,离体和体内试验结果相一致。

3.2花柱内是否存在Ca2+分布梯度

花柱内Ca2+是否具有梯度分布在不同植物上的研究结果不尽一致。在油菜{14],向日葵[15] 、陆地棉[16] 和水稻[17]等植物中没有发现Ca2+的梯度分布现象。在金鱼草[11]雌蕊组织中的研究表明存在着从柱头到胚珠Ca2+增加的梯度。烟草[19]中Ca2+沉淀颗粒呈梯度分布,越接近子房,引导组织之间的细胞壁中的Ca2+颗粒越多。在莴苣[20]中,授粉前花柱中的Ca2+虽不多,但从花柱顶端至基部的引导组织和其外围的薄壁组织中已呈现出了明显的Ca2+颗粒递增的梯度分布特征。本研究认为猕猴桃花柱顶端和基部在授粉前和花粉管刚刚穿过柱头生长没有到达柱头底部前存在Ca2+分布梯度,而在花粉管穿过花柱基部以后这种Ca2+梯度就会减弱或消失。分析不同植物Ca2+分布梯度存在与否的原因,有研究认为的向日葵、陆地棉、水稻不存在Ca2+梯度可能与该三种植物花柱很短,授粉到受精的时间为数小时到十余小时,花柱中无需Ca2+的梯度分布定向吸引[19]的结论似乎与本研究结果相矛盾,‘天源红’花柱只有4mm左右,而且在授粉后7h,花粉管生长就已经到达花柱底部进入子房,在花粉管没有到达花柱底部前,Ca2+梯度依旧存在,定向吸引花粉管生长,而花粉管完全进入子房开始生长以后,花柱中的这种Ca2+梯度作用就会减弱或者消失。所以,不同植物花柱中Ca2+梯度分布的差异有可能与植物的种类和检测时间有关。至于猕猴桃子房中的胚囊各部位与花柱间是否存在Ca2+梯度问题需要进一步开展研究方能确定。

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发布日期:2020年02月16日  所属分类:网文
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